吉林層析介質(zhì)生產(chǎn)廠家
發(fā)布時(shí)間：2023-06-08 01:48:16
吉林層析介質(zhì)生產(chǎn)廠家
金屬螯合親和層析介質(zhì)：組氨酸（His）的殘基上帶有一個(gè)咪唑基團(tuán)，可以和Ni2+,Co2+等過渡金屬離子形成配位鍵而選擇性的結(jié)合在金屬離子上，這些金屬離子能夠用螯合配體固定在層析介質(zhì)上，因此帶有組氨酸標(biāo)簽的蛋白在經(jīng)過裝配了金屬離子的層析介質(zhì)時(shí)可以選擇性的結(jié)合在介質(zhì)上，而其他的雜質(zhì)蛋白則不能結(jié)合或者僅能微弱結(jié)合。結(jié)合在介質(zhì)上的HIS標(biāo)簽蛋白可以通過提高緩沖液中的咪唑濃度進(jìn)行競爭性洗脫，從而得到較高純度的HIS標(biāo)簽蛋白。
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His-Tag純化時(shí)金屬螯合介質(zhì)的選擇：1、科研微量制備——Ni Seplife HP（IDA)，此層析填料分辨率高，科研微量制備可用此填料純化，純度更高。2、樣品中含有DTT或EDTA——Ni Seplife FF(TED),此填料可以耐受100mM的EDTA及10mM的DTT,樣品中含有EDTA及DTT時(shí)無需換液直接過鎳柱純化。3、樣品中含有8M尿素（6M鹽酸胍）——Ni Seplife FF(NTA),IDA耐受性差，TED結(jié)合力弱，在含有高濃度尿素時(shí)結(jié)合效率差，所以含有變性劑的樣品首選IMAC的鎳柱。
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如果選擇大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，最終目的可溶性表達(dá)或包涵體形式，由于包涵體中有高豐度的重組蛋白，包涵體的分離本身構(gòu)成了純化的重要步驟; 這必須與溶解難易和隨后包涵體中再折疊靶蛋白的難易以及可溶性蛋白的最終產(chǎn)量相平衡 。已經(jīng)有許多工作優(yōu)化了從包涵體中產(chǎn)生功能蛋白的產(chǎn)量 。
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層析填料被污染或老化：隨著填料的使用，一些雜質(zhì)的積累會(huì)使層析填料的孔徑發(fā)生變化（如堵塞，非特異性吸附積累，微生物污染，破碎等），導(dǎo)致其排阻能力發(fā)生偏差而影響分離度。此時(shí)可對(duì)填料進(jìn)行CIP清洗，若清洗后還不能達(dá)到分離要求，就要更換新的填料。
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溶菌緩沖液和純化工藝的前期步驟中常常會(huì)添加蛋白酶抑制劑以防止目標(biāo)蛋白質(zhì)被內(nèi)源性蛋白酶酶解。而純化工藝的后期一般不用再添加這些蛋白酶抑制劑，因?yàn)榇藭r(shí)幾乎所有的蛋白酶都已經(jīng)從目標(biāo)蛋白質(zhì)分離出去。蛋白質(zhì)的保存緩沖液中通常要添加金屬螯合劑，如EDTA或EGTA。這些金屬螯合劑與 Mg2+結(jié)合以防止目標(biāo)蛋白質(zhì)被所含的金屬蛋白酶分解。還有一些其他的添加劑，主要是用來保護(hù)蛋白質(zhì)不被破壞和增強(qiáng)其溶解性。
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預(yù)活化介質(zhì)：環(huán)氧活化層析介質(zhì)是將環(huán)氧基團(tuán)鍵合在瓊脂糖FF上形成的一種活性中間體，可直接偶聯(lián)配基制備各類分離介質(zhì)，用于生物大分子純化分離。溴化氫活化瓊脂糖層析介質(zhì)是一種活化后的中間體，通過溴化氫和瓊脂糖上面的羥基反應(yīng)生成活化的氰酸酯基團(tuán)。蛋白質(zhì)，多肽，氨基酸等可以偶聯(lián)到溴化氫活化4B/6B瓊脂糖介質(zhì)上，應(yīng)用較為廣泛。